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Virus e batteri (Farsi un'idea Vol. ) (Italian Edition) eBook: Michele La Placa: efycymepodor.tk: Kindle Store.
Table of contents



I segmenti di L3-L5 ricevono la maggior parte dell'input sensoriale dall'arto posteriore ipsilateral al sito di iniezione.

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Please recommend JoVE to your librarian. Notare che il promotore e il sierotipo possono avere un impatto sulla diffusione della trasduzione virale cfr. La prima parte del presente protocollo descrive brevemente la generazione di due diversi vettori AAV Cre-dipendente adatti per guadagno e perdita di esperimenti di funzione, rispettivamente. Al fine di illustrare i livelli di espressione che possono essere ottenuti tramite l'iniezione intraspinal di rAAV codifica una proteina marker, abbiamo iniettato prima AAV1.

Tre iniezioni a distanza di circa 1 mm prodotta un'infezione quasi continua dei segmenti spinali lombari L3 a L5 Figura 1A -C. Tuttavia, le cellule infettate potrebbero essere trovate anche nel corno ventrale Figura 1. Successivamente, l'obiettivo era di illustrare la differenza nell'espressione rAAV-mediata quando si inietta un rAAV Cre-dipendente in un topo transgenico Cre.

Pertanto abbiamo iniettato il AAV1 Cre-dipendente. Analoga all'espressione virale osservata dopo tre iniezioni di AAV1.

Cre Figura 2A C. Il comportamento avversivo portato a lesioni autoinflitte, che ha potuto essere osservate sulle zampe, polpaccio e la coscia per dati, vedere Foster et al.

MICHELE LA PLACA

Questi risultati dimostrano che tre iniezioni di rAAV nel midollo spinale lombare sono in grado di trasdurre una zona del midollo spinale lombare sufficiente per osservare i cambiamenti comportamentali robusti evocati da stimolo del hindlimb corrispondente. In un ultimo gruppo di esperimenti, abbiamo voluto dimostrare le differenze potenziali utilizzando topi reporter Cre rispetto ai virus reporter Cre. Spinali trasverse delle vertebre TL6 sono colorati come riferimenti anatomici e una freccia indica la cresta iliaca.

C immagine rappresentativa di un intero supporto nel midollo spinale lombare. Fluorescenza verde indica virus trasdotte aree del midollo spinale. D l'immagine rappresentativa di una sezione trasversale attraverso un midollo spinale lombare AAV1-eGFP-trasdotte da un mouse di tipo selvatico. E immagine rappresentativa di una sezione trasversale di un AAV1.

Le linee tratteggiate rappresentano la struttura della materia grigia e superficiale corno dorsale del midollo spinale. C tre iniezioni di AAV1. Cre hanno portati a una profonda perdita di neuroni inibitori nei rispettivi segmenti del ipsilateral ma non del lato controlaterale.

Cre topi iniettati con AAV1. E perdita di GlyT2 neuroni evocato comportamento avversivo spontaneo che ricorda del prurito cronico.


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F hM3Dq-ha mediato l'attivazione dei neuroni GlyT2 alleviato dolore meccanico nocivo evocato da stimolo di puntura di spillo. G hM3Dq-ha mediato l'attivazione dei neuroni GlyT2 ridotto pruritogen clorochina o istamina -evocato comportamento avversivo. Le frecce indicano double-labeled astrociti nella lamina III. Questo protocollo consente la trasduzione dei tre principali segmenti spinali innervati dai neuroni sensoriali, estendendo loro assoni periferici per l'arto posteriore.

Transducing tre segmenti produce dati comportamentali robusti e riproducibili. Ad esempio, lo stesso regime di iniezione consente di test la zampa von Frey, Hargreaves, ecc. Ci sono diversi passaggi critici per ottenere dati morfologici e comportamentali affidabile e per evitare artefatti. Danni al midollo spinale potrebbero compromettere sensazioni somatiche e coordinazione motoria del mouse, compromettendo qualsiasi pianificati esperimenti comportamentali. Tessuto spinale al sito di iniezione deve essere esaminata alla fine dell'esperimento per verificare successo iniezione e trasduzione del sito di inoculo e per escludere danni di tessuto in eccesso come conseguenza della chirurgia.

BRUNO CARLI

Diversi parametri del protocollo possono essere adattati alla popolazione neuronale e la domanda di ricerca per essere studiato. Ad oggi, sono stati utilizzati principalmente due tecniche funzionalmente interrogare i circuiti neuronali, necessari per la trasmissione dei segnali sensoriali. Molti ricercatori hanno usato le iniezioni intraspinal di rAAV codifica per reporter ed effettrici proteine in topi che esprimono recombinase per etichettare e manipolare le sottopopolazioni neuronali spinali.

Questo si ottiene inserendo due delle tre iniezioni nello spazio intervertebrale rostrale e caudale delle vertebre T13 e secondo, da un foro in T13 per la terza iniezione invece di rimuovere le vertebre. I segmenti mirati di L3-L5 sono l'area di terminazione principale dei neuroni sensoriali che innervano l'arto posteriore. Qui, topi che esprimono una ricombinasi in un sottoinsieme specifico dei neuroni spinali devono essere attraversati per topi reporter al fine di ottenere l'espressione del marcatore desiderato o proteine effettrici nel sottoinsieme di un neurone rispettivi 17 , 18 , Allo stesso modo, Gutierrez-Mecinas et al.


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Dymecki e colleghi, come pure i gruppi di Ma e Goulding, hanno sviluppato modi eleganti dell'utilizzo di approcci basati su mouse Intersezionali reporter che evitare di ricombinazione in parti del sistema nervoso che deve rimanere inalterato 17 , 18 , 19 , 21 , 22 , Ringraziamo Hanns Ulrich Zeilhofer per sostenere generosamente questo lavoro. Ringraziamo Carmen Birchmeier per l'anticorpo di Lmx1b. You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

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Ablazione perdita di funzione Nota: Le tossine batteriche o tossina recettori utilizzabile per mediare ablazione delle cellule o il silenziamento di un neurone. Per generare un vettore virale Cre-dipendente, selezionare un vettore di Cre-dipendente con un promotore adatto ad es. Amplificare la sequenza codificante di scelta ad es. Legare i frammenti purificati. Trasformare la reazione di legatura in batteri adatti, secondo il protocollo dato dal fornitore dei batteri competenti della scelta e i batteri sui piatti della libbra della lastra.

Verificare successo clonazione di restrizione digest e sequenziamento del plasmide Estratto del DNA. Invia DNA amplificato ad un impianto di nucleo di vettori virali per la produzione di virus. Virus sono infettivi reagenti e devono essere smaltiti secondo le linee guida pertinenti. Il giorno dell'iniezione, sbrinamento un'aliquota di riserva del virus purificato desiderata sul ghiaccio e tenerlo su ghiaccio fino a quando non direttamente prima dell'iniezione. Il titolo appropriato dipende gli obiettivi sperimentali e dovrebbe essere determinato sperimentalmente.

Utilizzare un filamento riscaldatore di 3,0 mm e impostazioni di programma 00 con p a adattato come in tabella 1. Usando un microscopio con una scala di micrometro, misurare il diametro interno di micropipette diversi per avere un'idea di quanto sia grande l'apertura dovrebbe essere, o misurare per ogni micropipetta. Non lasciare qualsiasi disinfettante sulla siringa microliter che danneggerebbe il vettore virale deve essere utilizzato.

Preparazione dell'animale per la chirurgia e l'anestesia Nota: Scegli 6 - ai 10 - settimana-vecchi topi per facilitare la procedura chirurgica. Qualsiasi ceppo ed entrambi i sessi possono essere utilizzati in linea di principio, ma utilizzano lo stesso ceppo di sfondo ad es.

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Se le differenze del sesso sono attesi o da indagare, analizzare i maschi e le femmine in gruppi separati. Monitorare il tasso di respirazione durante l'intervento chirurgico. Applicare unguento oculare lubrificante per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico. Radere la parte posteriore dell'animale e rimuovere i capelli accuratamente con tessuti bagnati.

I 10 virus e batteri più letali per l’umanità

Disinfettare la pelle rasata con soluzione di iodio e consentire la pelle si asciughi. Dare il trattamento analgesico per esempio , 0. Esposizione della colonna vertebrale a livello lombare del midollo spinale Nota: Sollevare la pelle con il forcipe e staccarlo dal muscolo sottostante con le forbici. Utilizzando una pinzetta e piccole forbici, fare un'incisione nel prossimo, sottile strato membranoso proprio accanto alla linea mediana e tagliarlo dai processi spinous. Identificazione delle vertebre a livello lombare del midollo spinale Nota: Tirare la pelle indietro verso la coda per esporre la cresta iliaca.

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